抗體下游純化之內(nèi)毒素去除“攻略”
內(nèi)毒素（Endotoxin）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要成分—脂多糖（LPS），在細(xì)菌死亡或裂解后釋放，其具有強(qiáng)生物活性，微量即可引發(fā)機(jī)體發(fā)熱、腹瀉、休克等病理反應(yīng)。根據(jù)《中國藥典》（2020年版），靜脈注射用藥的內(nèi)毒素限度一般為5 EU/kg·h（按患者體重和給藥時(shí)長計(jì)算），而鞘內(nèi)注射藥物的標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格（0.2 EU/kg·h）。美國FDA和歐洲EMA也有類似規(guī)定，要求制藥企業(yè)必須證明其生產(chǎn)工藝能穩(wěn)定地將內(nèi)毒素水平控制在安全限度以下。因此在抗體藥物等生物制品的生產(chǎn)過程中，內(nèi)毒素控制是確保產(chǎn)品安全性的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)之一。
1 為什么要去除內(nèi)毒素？
內(nèi)毒素的化學(xué)本質(zhì)為脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS），LPS分子由三部分組成：O-特異性多糖鏈、核心多糖和類脂A（Lipid A）。其中類脂A是LPS的生物活性中心，也是引起宿主免疫反應(yīng)的主要部分。類脂A可通過靶細(xì)胞的受體蛋白分子相互作用，激活復(fù)雜的信號通路，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列病理反應(yīng)，造成器官受損、休克甚至人體死亡等。
在生物制品生產(chǎn)過程中，除大腸桿菌體系（常用于表達(dá)重組蛋白）可直接帶來內(nèi)毒素污染源外，設(shè)備、系統(tǒng)、原材料或操作過程等環(huán)境因素都可能中引入內(nèi)毒素污染。例如，細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基、過濾器及生產(chǎn)環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)等都可能成為內(nèi)毒素的來源。此外，內(nèi)毒素還可能通過與目標(biāo)蛋白結(jié)合的方式進(jìn)入最終產(chǎn)品中，導(dǎo)致產(chǎn)品污染。
在上游研發(fā)及培養(yǎng)中采取有效預(yù)防措施，可以從宿主細(xì)胞選擇（優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞）、培養(yǎng)基與原料控制（盡量使用無動(dòng)物源成分培養(yǎng)基）、生物反應(yīng)器操作（封閉式生產(chǎn)系統(tǒng)）以及環(huán)境控制等方面減少內(nèi)毒素引入。
2 抗體下游純化如何去除內(nèi)毒素？
內(nèi)毒素在常規(guī)條件下帶負(fù)電，在高鹽環(huán)境下會(huì)凝集，形成較大的聚集體。由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，內(nèi)毒素在生物制品中難以被完全去除，因此需要通過多種純化手段進(jìn)行有效控制?？贵w下游純化是一個(gè)多步驟的過程，典型流程包括：親和層析、病毒滅活及過濾、離子交換層析、除病毒過濾和超濾濃縮等。賽分科技結(jié)合抗體下游純化步驟和層析填料，探究不同層析方法對內(nèi)毒素的去除效果。
親和層析
原理：1. 非特異性共洗脫：內(nèi)毒素本身不直接結(jié)合蛋白A填料，但可通過疏水作用或離子相互作用與抗體或宿主蛋白結(jié)合，隨目標(biāo)產(chǎn)物一同洗脫。
2. 抗體依賴性：不同抗體類型（IgG1/2/4）與內(nèi)毒素的結(jié)合強(qiáng)度存在顯著差異，其中雙特異性抗體因結(jié)構(gòu)特殊性更易形成穩(wěn)定復(fù)合物。
優(yōu)化策略：向淋洗液中加入添加劑：
1. Triton X-100（1%濃度）：通過競爭性結(jié)合內(nèi)毒素的類脂A結(jié)構(gòu)域，阻斷其與抗體的疏水相互作用。
2. EDTA（3 mM濃度）：螯合二價(jià)陽離子（如Ca²?、Mg²?），破壞內(nèi)毒素聚集體的穩(wěn)定性。
3. L-精氨酸（0.5 M濃度）：提供高離子強(qiáng)度環(huán)境，削弱靜電相互作用，同時(shí)改變?nèi)芤簶O性。
純化案例
蛋白A親和填料—MabPurix A65 Excel （去除率：2.12 log10）
樣品信息：某單抗發(fā)酵液，上樣載量50 g/L
離子交換層析
原理：內(nèi)毒素分子的等電點(diǎn)在2左右，內(nèi)毒素在pH4~8的緩沖體系中帶大量負(fù)電荷。通常與陰離子交換填料的正電荷配基相結(jié)合，并在高濃度鹽時(shí)將其去除。而在pH4時(shí)，內(nèi)毒素還是帶負(fù)電荷，與陽離子交換填料不能結(jié)合，對于陽離子交換填料，可以采用目標(biāo)物結(jié)合而內(nèi)毒素流穿的方式，去除內(nèi)毒素。
優(yōu)化策略：
陰離子流穿：提高上樣pH，降低載量。
陰離子結(jié)合：在淋洗步驟中加入TritonX-100、TritonX-114、精氨酸、組氨酸等添加劑。
純化案例
陰離子交換填料—Monomix Mab60-Q（去除率：2.57 log10）
樣品信息：某單抗 AC Pool，上樣載量150 g/L
陽離子交換填料—Monomix Mab60-SP（去除率：1.69 log10）
某單抗 AC Pool，上樣載量50 g/L
疏水層析
原理：內(nèi)毒素的疏水特性，使得在高鹽濃度（大于1.5 M 硫酸銨）時(shí)容易發(fā)生聚集，且聚集體與疏水填料不結(jié)合，而部分未聚集的內(nèi)毒素與填料結(jié)合緊密而不易洗脫，所以，上樣時(shí)聚集部分直接流穿而去除內(nèi)毒素，而未聚集部分保留較強(qiáng)（小于0.4~0.5 M硫酸銨），可通過鹽梯度洗脫去除結(jié)合部分的內(nèi)毒素。
優(yōu)化策略：在上樣樣品添加1 M精氨酸，降低內(nèi)毒素與蛋白質(zhì)的相互作用，達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的。
純化案例
疏水填料—Generik MC60-HIC Butyl（去除率：0.23 log10）
樣品信息：某單抗-AC Pool，上樣載量40 g/L
復(fù)合模式層析
原理：復(fù)合模式層析能同時(shí)提供不同類型的相互作用力，包括電荷作用、疏水作用等。由于內(nèi)毒素通常帶大量負(fù)電荷，疏水性強(qiáng)，可以通過離子交換電荷效應(yīng)、疏水等相互作用去除內(nèi)毒素。
優(yōu)化策略：由于復(fù)合模式層析填料兼具離子交換特性和疏水層析特性，優(yōu)化策略可參考兩者。
純化案例
復(fù)合陰離子交換填料—Agarosix MC75-MMA（去除率：1.12 log10）
樣品信息：某單抗 AC Pool，上樣載量150 g/L
復(fù)合陽離子交換填料—Agarosix MC75-MMC（去除率：3.185 log10）
樣品信息：某單抗 AC Pool，上樣載量50 g/L
注：log10值為對數(shù)去除率（log reduction,LRV，也稱對數(shù)減少值），0.5-1 log10（去除率：68.4–90%）；
1–2 log10（去除率：90–99%）；
2–3 log10（去除率：99–99.9%）；
3–4 log10（去除率：99.9–99.99%）。
小結(jié)
根據(jù)內(nèi)毒素的對數(shù)去除率（log10值）可以看出，親和層析和陰離子交換層析的內(nèi)毒素去除均可以達(dá)到2 log10以上，能高效去除內(nèi)毒素；陽離子交換層析在1.5 log10以上，傳統(tǒng)的親和+陰陽離子純化工藝?yán)鄯e清除率在5 log10（賽分科技優(yōu)化策略達(dá)到6 log10）以上，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛；疏水層析的log10值（小于0.5 log10）較低，去除內(nèi)毒素效率較低，實(shí)際抗體藥物純化工藝中應(yīng)用較少；復(fù)合陽離子交換填料Agarosix MC75-MMC通過一步層析即可實(shí)現(xiàn)>3 log10的內(nèi)毒素去除率，展現(xiàn)出超高效清除能力，為抗體純化工藝的簡化與優(yōu)化提供新思路。
推薦填料及訂購信息
注：包裝規(guī)格為1 L，5 L, 10 L, 50 L，預(yù)裝柱規(guī)格為1 mL, 4.2 mL, 5 mL
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